El 23 de noviembre de 1504, tres días antes de su muerte, la reina Isabel firma en Medina del Campo un codicilo en presencia del mismo notario, Gaspar de Gricio, y de cinco de los siete testigos que habían asistido el 12 de octubre anterior al otorgamiento y firma de su testamento.

Si la reina se había referido en el testamento a los aspectos fundamentales del gobierno de los Reyes Católicos, en el codicilo, además de expresar su deseo de aprobar lo que había dispuesto en el testamento, aborda, por un lado, cuestiones que afectan directamente al gobierno peninsular y, por otro, muestra su preocupación por la política que está ejerciendo España en América, sentando las bases de las Leyes de Indias. El deseo de la reina, que disponía en la última cláusula del testamento el traslado del mismo y del codicilo original al monasterio de Nuestra Señora de Guadalupe, no se verá cumplido, pues se sabe que entre los años 1543 y 1545 el testamento se llevó al Archivo de Simancas, y el codicilo, que extrañamente se había desgajado del testamento, se incorpora a la Biblioteca Real, formando parte de un tomo de varios (T. 301) del que se separa en 1881. Actualmente se conserva en la Biblioteca Nacional de España.

El codicilo comienza con una breve salutación a la divinidad para ratificar a continuación lo expresado en el testamento. Siguen las diecisiete cláusulas que constituyen el cuerpo del codicilo y la rúbrica de la reina con los restos del sello de placa real. Finaliza el documento con la suscripción notarial y las firmas y sellos de los cinco testigos.

Escrito en letra humanística-cortesana en tres hojas de pergamino con una hoja más que sirve de cubierta, tendría el codicilo en su estado original un aspecto similar al testamento, a pesar de la pérdida del sello de placa real y de haber sido desencuadernado en 1969.