El fons inicial es va formar amb les col·leccions reals, a les quals es van unir, a principis del segle XVIII, els manuscrits que havien acompanyat a Felipe V des de França i els de les biblioteques nobiliàries confiscades en la Guerra de Successió, especialment les biblioteques pertanyents a Gaspar Ibáñez de Segòvia i Peralta, marquès de Mondéjar (1708) i a Juan Francisco Pacheco Téllez Girón, duc consort d'Uceda (1711). Dues importants permutes amb el Convent de Sant Tomás d'Àvila i amb el Convent de Sant Vicent de Plasencia i l'adquisició de biblioteques nobiliàries i d'erudits enriquiran considerablement la col·lecció de manuscrits en aquest primer segle d'existència.

Al llarg del segle XIX s'incorporaran per compra biblioteques particulars com les de Juan Nicolás Böhl de Faber, Agustín Durán o Serafín Estébanez Calderón. Successius decrets de desamortització sobre els béns artístics, bibliogràfics i documentals de l'Església van tenir com a conseqüència l'entrada en diversos museus, arxius i biblioteques de l'Estat, de part important d'aquests béns. D'aquesta manera van arribar a la Biblioteca Nacional un conjunt d'antics manuscrits de gran interès artístic i codicológico. Si hi ha un any clau en l'increment de la col·lecció de manuscrits és 1886, en què s'adquireix la biblioteca de la casa ducal d'Osuna i Infantado, amb la qual ingressa la biblioteca del Marquès de Santillana i la biblioteca dels Comtes de Benavente. La compra de la biblioteca de Pascual de Gayangos, de gran diversitat temàtica i cronològica, serà un altre important fita en la col·lecció, a la qual s'unirà la donació de la biblioteca de Luis Usoz i Riu i dels papers del compositor Francisco Asenjo Barbieri.

La donació del còdex del Cantar de Meu Cid en 1960 serà una altra data estel·lar, començant un període de diversitat en els manuscrits que s'incorporen a la col·lecció, que perdura fins a l'actualitat. En els últims anys, l'arribada d'epistolarios d'importants figures de la literatura contemporània com Rafael Morales, Roberto Bolaño o la hispanista Mathilde Pomés ha situat la col·lecció de manuscrits de la BNE en un lloc rellevant del nostre patrimoni bibliogràfic